Développement d'une méthode de détection des poissons dans les denrées alimentaires par QPCR et d'identification de l'espèce par séquençage dans l'entreprise Progenus

Abstract

De nombreuses fraudes liées aux poissons existent sur le marché. Deux d’entre elles sont les fraudes de substitution et les fraudes d’étiquetage. La fraude de substitution est le remplacement d’une espèce de poisson par une autre, moins chère, et vendue au prix de l’espèce remplacée. La fraude d’étiquetage est l’absence d’annonce de présence de poissons, un allergène à déclaration obligatoire, dans l’aliment. Pour mettre à jour ces deux fraudes, l’entreprise Progenus a pour objectif de mettre au point une technique de détermination de l’espèce par séquençage et de détection de poissons par qPCR. Une banque d’échantillon de poissons a été récoltée. Cette banque représente 95% des ordres consommés mondialement et est représentatif de la consommation française et belge d’espèce de poissons de 99% (en quantité). Un test qPCR in-house pour vertébrés a révélé que l’ADN des échantillons pouvait être amplifié sans problème excepté les poissons provenant de conserves et le maquereau fumé dont l’ADN était sûrement sévèrement dégradé et les anchois marinés qui avaient des inhibiteurs de PCR tels que des sels at acides acétiques Lors du développement de la technique de séquençage, trois gènes ont été ciblés : 16S, cytochrome b et cytochrome c oxydase. Lors des essais, le premier gène a permis de déterminer l’espèce, le genre, la famille ou l’ordre selon les espèces séquencées. Les deux gènes du cytochrome permettent la détermination du genre dans tous les cas et théoriquement, de l’espèce dans plus de 95% des cas. L’analyse des séquences de trois poissons a révélé qu’ils étaient l’objet de fraude de substitution : le thon rouge qui était du thon albacore, la petite roussette qui était de l’aiguillat commun et la dorade grise qui était en réalité de la daurade royale. Certaines optimisations ont été apportées, afin d’augmenter la spécificité des amorces et le taux de succès d’amplification, telle que le nombre de cycles de PCR et la température d’hybridation optimale. La méthode reste à optimiser par les concentrations des différents réactifs. Pour la détection des poissons par qPCR, quatre gènes ont été testés : 18S, α-skeletal actin gene, l’Hoxc13 et un gène confidentiel appelé FISHES dans ce travail. Seul le gène FISHES semble permettre une détection spécifique des poissons. Des améliorations de la méthode ont été apportées : le design d’une amorce permettant d’amplifier les siluriformes, une température d’hybridation baissant l’amplification des amplicons des animaux autres que les poissons et une séquence permettant le design d’une sonde a été trouvée. La technique n’est pas encore aboutie et les sondes doivent encore être testées. Ce travail a permis de fournir à Progenus une banque d’échantillons de poissons. L’utilisation des amorces pour le cytochrome b et cytochrome c oxydase permet de discriminer les espèces de poissons. L’élaboration d’une méthode d’amplification spécifique pour les poissons du gène FISHES devrait permettre, avec une sonde adaptée, la détection de traces de poissons par qPCR.