The case of hidden viruses in germplasm collections: database mining, laboratory testing and genome characterization

Abstract

Bananas, and more specifically cooking bananas, are of a high importance for the food security of millions people since it is considered as both staple food and cash crop. However, the banana plantations can be threatened by many pests, including viruses. The viruses benefit from the plant vegetative reproduction and are easily transmitted to the progeny. One way to reduce viral infections in plantations is using clean planting material. Nevertheless, to achieve this goal, viral detection tools should be reliable, otherwise unwanted viruses may contaminate banana plantations. This master thesis aimed to contribute to the release of clean material by the improvement of diagnostic techniques for banana viruses, such as banana mild mosaic virus (BanMMV). More specifically, we wanted to i) screen the transcriptomics database (Serratus) to identify new host species for banana viruses; ii) test the performance of the protocol of the new primers to detect BanMMV in old and hidden accessions; and iii) assess quality of the BanMMV sequences available in public databases. First, using bioinformatical tools on Serratus database, a new isolate of BanMMV was found to infect an unknown host, the yam specie Dioscorea alata, and an uncharacterized virus of the same family, the Betaflexiviridae, was also found in another plant species, Pueraria candollei (Fabaceae). Secondly, a test based on newly designed primers for the detection of BanMMV was evaluated by bioinformatics analyses for its analytical specificity and by RT-PCR for its analytical sensitivity, repeatability and reproducibility. It exhibited a high sensitivity (detection up to a dilution of 1,000x) and 100% repeatability and reproducibility for the detection of BanMMV. However, while the bioinformatical analyses indicated a good specificity, Sanger sequencing results showed the capacity of the new primers to detect musa ornata-associated Banmivirus (MoaBV), a close relative of BanMMV. Thirdly, 55 Genbank complete BanMMV sequences were analyzed to remove non-viral parts at their extremities and, in one case, to modify the position of an open reading frame (ORF). We observed that 6 of them contained at least 10 bases at one extremity that were not recognized as viral, and 3 of those extremities were identified as plant genome. The problematic bases were deleted or corrected to ensure that the final sequences contained viral genome only. Last but not least, multiple accessions of banana plants from the Internal Transit Centre (ITC) germplasm collection (Bioversity International) previously tested negative to BanMMV were actually found positive using new primers. In conclusion, the host range of BanMMV has been broadened and an inclusive, highly sensitive test has been validated and used to detect BanMMV in accessions that were previously thought to be virus-free. This issue poses a threat to the safety of banana plantations and the germplasm collection should be re-checked to reduce the risk of BanMMV-infected accessions being distributed.

Les bananes, et plus particulièrement les bananes à cuire, sont tout autant une denrée de base qu’une culture commerciale et occupent dès lors une place importante dans la sécurité alimentaire de millions de personnes. Néanmoins, les bananeraies sont menacées par différents nuisibles, dont les virus. Ces derniers bénéficient de la reproduction végétative de la plante et sont facilement transmis à leur descendance. Plusieurs méthodes existent afin de diminuer les infections virales dans les plantations. L’une d’elles consiste à utiliser un matériel végétal sain lors de la plantation. Afin d’y parvenir, la détection virale en amont doit être fiable. Ce mémoire a pour objectif de contribuer à la distribution de matériel végétal sain en améliorant des techniques de diagnostic des virus de bananiers tel que le banana mild mosaic virus (BanMMV). Les axes de recherches étaient de i) passer en revue la base de données transcriptomiques Serratus afin d’identifier de nouvelles plantes hôtes de virus de bananiers, ii) tester la performance d’un protocole de nouvelles amorces dédiées à la détection du BanMMV dans des accessions testées précédemment, iii) contrôler la qualité de séquences de BanMMV disponibles dans les banques de données publiques. Tout d’abord, en utilisant la base de données transcriptomiques, un nouvel isolat du BanMMV a été découvert dans de l’igname (Dioscorea alata), une plante hôte encore inconnue pour ce virus, et un virus non caractérisé de la même famille, les Betaflexiviridae, a été trouvé dans une autre espèce végétale, Pueraria candollei (Fabaceae). Ensuite, le protocole de nouvelles amorces dédiées à la détection du BanMMV a été évalué par analyses bioinformatiques pour sa spécificité analytique ainsi que par analyses en laboratoire pour sa sensibilité analytique, sa répétabilité et sa reproductibilité. Il manifeste une grande sensibilité analytique avec une détection jusqu’à une dilution de 1,000x. De plus, la répétabilité et la reproductibilité ont toutes deux atteint 100%. Néanmoins, tandis que les analyses bioinformatiques indiquaient une bonne spécificité, les résultats de séquençage Sanger ont montré la capacité des nouvelles amorces à détecter le musa ornata-associated Banmivirus (MoaBV), un virus proche du BanMMV. En outre, les séquences Genbank complètes de BanMMV ont été analysées afin de retirer les parties non virales de leurs extrémités. Une des séquences a de plus fait l’objet d’une modification de l’un de ses open reading frames (ORF). Parmi les 55 séquences analysées, 6 d’entre elles comportaient à minima une extrémité contenant au moins 10 bases non reconnues comme virales par NCBI. La moitié de ces séquences problématiques étaient constituées en partie de génome végétal. Les bases en question ont été supprimées ou corrigées afin que la séquence finale contienne uniquement du génome viral. Finalement, plusieurs accessions de bananiers venant de la collection de germplasmes de l’Internal Transit Centre (ITC, Bioversity International) précédemment testées négatives au BanMMV ont été révélées positives en utilisant le protocole des nouvelles amorces BanMMV. En conclusion, la gamme d’hôtes connus du BanMMV a été élargie et un test inclusif et sensible a été validé et utilisé afin de détecter des accessions précédemment considérées comme saines. Cette problématique représente une menace pour les bananeraies et la collection de germplasmes devrait être revérifiée afin de diminuer le risque de distribution d’accession atteinte par le BanMMV.